环肽具有显著增强的结构刚性，在代谢稳定性、亲合力、特异性、细胞膜穿透性等方面经常有更为优异的性质，能够作用于传统认识中许多“non-druggable”的靶标，如蛋白质间相互作用。同时，与抗体等蛋白质相比，多肽的生产成本较低，易于修饰、储存和运输。因此，环肽成为了当前药物研发的热点领域。
通过基因工程技术构建容量极大的环肽文库（>10^7），结合高通量的筛选策略，人们能够快速高效的获得具有特定活性的先导环肽。就这方面来说，当前主要合成生物技术有三种，包括噬菌体环肽展示、mRNA环肽展示（如RaPID技术）以及基于分裂内含肽的SICLOPPS（split intein-mediated circular ligation of peptides and proteins）。其中，SICLOPPS能够在细胞内形成首尾相连的环肽分子，支持细胞内基于功能的活性环肽挖掘，对于环肽的应用研究起到了巨大的推动作用。然而，SICLOPPS通常只能产生包含6个氨基酸残基的环肽，结构的多样性和复杂度受到了极大的限制。
近期，天津大学医学部生命科学学院/合成生物技术全国重点实验室轩维民教授课题组、南开大学陈弓教授课题组、大连理工大学秦洪强教授课题组，合作在Angew. Chem. Int. Ed.发表题为“In Cellulo Peptide Cyclization via Gene-Encoded Proximity-Induced Proline-Isothiocyanate Crosslinking”的研究论文，报道了基因编码的脯氨酸-异硫氰酸酯邻近交联策略，实现了细胞内环肽的高效、灵活构建，有望推动基于生物功能的先导环肽高通量挖掘。
异硫氰酸酯（ITC）广泛用于蛋白质中氨基的化学标记，也是蛋白质测序方法 Edman degradation sequencing中的关键反应试剂，一般认为反应不具特异性。论文作者基于N端氨基更低pKa值以及脯氨酸中二级胺更高的亲核活性，推测异硫氰酸酯与N端Pro在生理条件下能够特异性交联，形成硫脲键。为此，文章测试了ITC反应基团与蛋白质中不同氨基的二级反应速率常数，包括N端脯氨酸（Pro）、N端甘氨酸（Gly）以及赖氨酸侧链（Lys），发现与ITC的反应时，N端Pro的反应速率是Lys的129倍，且显著快于N端Gly，证明N端Pro与异硫氰酸酯的交联反应，即P-ITC交联具有很高的化学选择性。
进而，作者采用密码子扩展技术，以大肠杆菌为表达宿主，将具有ITC侧链的非天然氨基酸引入多肽，与N端Pro临近交联构建环肽。论文研究表明，P-ITC交联能够环化不同氨基酸数目的多肽（多至11个氨基酸），且序列中Lys不会影响交联特异性。同时实验表明，序列中高反应活性的Cys不会影响P-ITC交联，并可与硫脲键发生独特化学反应，释放硫化氢形成异硫脲结，从而构成更为独特的二环环肽。
实验中，作者们利用P-ITC交联反应构建了高亲和力结合Kelch蛋白的ETGE环肽以及包含二硫键的SFTI-1衍生物，证明了P-ITC交联在环肽研究中的巨大应用潜力，有望推动基于功能的环肽高通量筛选。
天津大学医学部生命科学学院硕士生毕业生黄志纷、南开大学博士生江帅为论文的共同第一作者，轩维民教授、陈弓教授、秦洪强教授为论文的共同通讯作者。该工作得到了国家重点研发计划以及国家自然科学基金的资助，以及天津大学医学部生命科学学院叶升教授的大力支持。
原文链接：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/anie.202517565
